Después de que Alfonso X el Sabio tomase posesión de El Puerto de Santa María en 1268, conocida como Al-Qanatir por los musulmanes, y como Alcanate por las tropas cristianas, tras cuatro años de luchas contra el islam, la aldea asentada en el lugar que hoy ocupa la urbe, es tomada y convertida en villa altomedieval cristiana, que crece y se desarrolla en torno al Castillo de San Marcos, mezquita islámica que será transformada en iglesia por el rey, y adaptada a la nueva situación.
Es a partir de este año, 1268, cuando se construye la primera muralla conocida que tendrá la ciudad, para defenderla de los ataques de los benimerines que llegarán más adelante, que en principio es bautizada como Santa María del Puerto por Alfonso, antes de hacer el repartimiento de la ciudad, tal como consta en la copia existente del Libro de Repartimiento de El Puerto de Santa María, conservado en el Archivo Municipal de ésta ciudad andaluza, y en la que se hace inventario de las tierras, calles y casas dejadas atrás, todo lo cual será patrimonio de distintos personajes que principalmente han participado en las batallas, y que en adelante se les conocerá con el gentilicio de porteños, nombre que más tarde pasará a denominarse portuenses, tal como se les conoce en la actualidad.
El Castillo de San Marcos será sede del Cabildo del Puerto de Santa María, en el cual funciona el Concejo de la ciudad bajo el mando de sus corregidores, y a finales del siglo XV, principios del XVI, alcanza un auge impresionante debido al impulso del descubrimiento de América, que con el paso de los años lo convertirá en sede de la Casa de Contratación, trasladada de Sevilla a Cádiz; esto ocurre desde el año 1666, aunque no será definitivamente hasta 1717 cuando Cádiz sustituya en esta representación a la institución oficial indiana.
El Puerto de Santa María fecha el primer mapamundi que incluye América, y durante los siglos XVI y XVII, la ciudad se convierte en base para la invernada de las Galeras Reales, además de Sede de la Capitanía General del Mar Océano, debido a las condiciones especiales que el río Guadalete proporcionan a las naves, aunque hacia 1668 las galeras son trasladadas a Cartagena por orden de la reina, esposa de Carlos II, porque la arena ha provocado que los fondos del río queden embarrancados, con el consiguiente problema de atraque para las naves, para cuya limpieza se cobraba un arbitrio del 2% aduanero sobre las mercancías de desembarco.
Estas galeras fondeaban frente al Muelle de las Galeras, que formaban la flota que defendía la costa en el Guadalete, y en él había una fuente de la que se surtían los barcos que iban a zarpar. Junto a los muelles estaba también la Ermita de Guía, a la que se encomendaban los navegantes antes de cada expedición.
El Puerto tenía una gran actividad mercantil y naviera, además de contar con una escuela de Pilotos navales, donde se forman marineros y navegantes, estando siempre por delante del resto de las ciudades portuarias. Desde aquí se fletaban barcos que recorrían las rutas de las especias, seda, etc., se tomaba el relevo a la Flota de Nueva España para el trasporte de la plata indiana hacia Génova, Venecia o Nápoles, mientras se sustituía la antigua ruta por tierra, que hizo que las galeras de Barcelona perdieran importancia en estos trasportes, los cuales serán a partir de este momento protagonizados por las naos castellanas y extranjeras que hacen la ruta del Mediterráneo.
El Puerto era el centro neurálgico de la información política de Europa, lugar donde la gente se reunía en sus puertos, sus mercados de almoneda o sus ventas, para conocer las noticias que ocurrían en los países extranjeros, en las Indias o en la propia España, tanto de la sociedad, como del mar o de la Corte.
En el Puerto se construyeron una gran multitud de palacios renacentistas, a raíz del auge comercial alcanzado por la ciudad, repartidos por todo el casco, tanto a orillas del río Guadalete, que en el siglo XV corría sin canalizar, como en el centro de la ciudad. Para ello, se tomaron materiales de arenisca provenientes de las canteras de la sierra de San Cristóbal, al norte de la provincia, lugar que surtió igualmente piedra para construir el Castillo de San Marcos y la Iglesia Prioral de Nuestra Señora de los Milagros, que estaba en el centro de la ciudad y a ella estaban ligados los miembros más importantes del Concejo y el gobierno de la villa, entre los que se hallaban Diego y Charles de Valera, de la familia Valera, una de las más importantes entre los Cargadores a Indias del Puerto de Santa María. En la Sierra de San Cristóbal se encontraba también la Ermita de Sidueña, y en lo alto de la zona ribereña había una posada del siglo XV, llamada Posada del Toro, que pertenecía a la familia de los Varela.
En aquella época, las calles tenían denominaciones distintas, lo que en ocasiones ha producido dificultades a la hora de investigar la ubicación de un lugar, o el estudio de una familia que está ligada a una dirección concreta en los manuscritos antiguos. Las aguas sucias que discurrían por la ciudad, corrían bajo la calle Ganado, que hoy existe todavía con su nombre. Otra calle era la calle Larga, que atravesaba el centro del casco urbano, y dividía la ciudad, pero en el casco encontramos otras calles importantes como la calle del Arco, que atravesaba una puerta en los restos de la muralla, pasando junto al antiguo palacio de los Duques de Medinaceli, hoy convertido en bodegas. Otras calles desaparecidas son la calle Vicario, Dulce Nombre de Jesús, calle del muro o Tripería.
El colectivo de Cargadores a Indias se hizo fuerte en el siglo XVII, al llegar comerciantes que hicieron prosperar El Puerto de Santa María. Muchos eran vascos o navarros, y los que procedían de Santander o Cantabria, por ejemplo, eran conocidos con el nombre de montañeses, pero también había italianos, flamencos o genoveses.
